熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中CT值出現(xiàn)異常的原因分析

     熒光定量PCR是生物醫(yī)學(xué)中常用的檢測(cè)核酸病毒的方法之一，由此，這幾年PCR 儀也成了近幾年臨床檢測(cè)和分子生物學(xué)研究的主要實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。 我們知道CT值是PCR 擴(kuò)增曲線中的重要參數(shù)，那么CT值是什么？它與 PCR擴(kuò)增存在什么關(guān)系？為什么有的時(shí)候基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn) CT 值異常甚至缺少CT值的情況？

什么是CT值？

     在熒光定量PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)（Fluorescence signal）達(dá)到設(shè)定的熒光閾值（FLUORESCENCE threshold）時(shí)的所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold）。也可以理解為在qPCR實(shí)驗(yàn)過程中初始模板擴(kuò)增到一定產(chǎn)物量值時(shí)，所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。 CT 值的表達(dá)公式為：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（ 1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)。

通常QPCR實(shí)驗(yàn)中CT值的異常主要有以下幾種情況：

 一、擴(kuò)增曲線正常，CT值偏大或偏小

從CT值表達(dá)公式中我們可以看出初始模板的質(zhì)量和擴(kuò)增效率，會(huì)直接影響到CT值的大小。 如果擴(kuò)增起始模板量濃度高或引物設(shè)計(jì)不合適那么所用的循環(huán)數(shù)就會(huì)小，即出現(xiàn)Ct值過小；反之，起始模板量濃度過低，Ct值會(huì)偏大。 PCR擴(kuò)增效率與 CT 值也是成反比關(guān)系，擴(kuò)增效率高則CT值小，擴(kuò)增效率低則需要要用到的循環(huán)數(shù)增加所對(duì)應(yīng)的CT值也會(huì)偏高。另外，合理的引物設(shè)計(jì)，防污染試劑的應(yīng)用也會(huì)影響到CT值的大小。

二、 有擴(kuò)增曲線，但卻沒有CT值，CT值顯示狀態(tài)為Undetermined

這種情況下你通常也會(huì)發(fā)現(xiàn)由于閥值位置不正常正常導(dǎo)致熒光閾值線與擴(kuò)增曲線沒有交點(diǎn)，所以儀器顯示狀態(tài)為Undetermined。出現(xiàn)這種如果擴(kuò)增模板濃度是正常的，那么多數(shù)原因可能是由于系統(tǒng)界面參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤所導(dǎo)致的。如果參與擴(kuò)增的模板并非所有的孔，而系統(tǒng)界面在所有的 （ C-H行）都默認(rèn) 設(shè)上了target和 sample 參與CT值計(jì)算。這個(gè)時(shí)候系統(tǒng)會(huì)默認(rèn)所有孔參與熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn) 。導(dǎo)致CT值錯(cuò)誤。如果我們把無樣品C-H 行 數(shù)的target和sample 前面的“√" 清除 后重新分析計(jì)算，就會(huì)得到正常的熒光閾值線 C T 值了。

三、 有擴(kuò)增曲線，閾值線的位置也正常，但大多數(shù)孔仍然不顯示CT值。

當(dāng)系統(tǒng)界面C-H行 顯示出現(xiàn)異常提示（比如黃色三角形標(biāo)示），在數(shù)據(jù)分析中會(huì)再很多孔內(nèi)出現(xiàn) BLFAIL提醒。這表明基線分析失敗，如果確定我們?cè)诜磻?yīng)物中加了熒光染料，如果加了，那么這種 熒光值偏低現(xiàn)象，可能由于使用了透光性不好PCR 耗材或不配套的耗材所導(dǎo)致。這種情況較容易出現(xiàn)在底部或側(cè)邊掃描檢測(cè)的PCR 儀器中；朗基的 Q2000系列采用的頂部CCD 實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)甚至可以用*不透明的白管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以一般不會(huì)存在這種問題。

四、 還有一種情況較為常見也就是擴(kuò)增曲線不正常，CT值都顯示“Undetermined"。 

此時(shí)，如果在熒光定量PCR檢測(cè)報(bào)告頁面出現(xiàn)了ROX的熒光值 為0的情況，很可能是使用了不含ROX 試劑而系統(tǒng)參數(shù)中未做修改所造成，及時(shí)在分析設(shè)置中將 Passive reference dye的ROX 改成None，再重新分析即可正常顯示。有些沒有ROX 校正的PCR 儀中也較容易出現(xiàn)此類問題。 

從上面Qpcr實(shí)驗(yàn)中常幾種常遇到的幾種情況中可以看出：要想獲得 準(zhǔn)確的pcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及樣本、配套試劑耗材、儀器類型的選擇、正確的軟件操作等都與實(shí)驗(yàn)本身密不可分。

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