熒光定量PCR的優化方法

使用熒光定量PCR儀進行定量PCR實驗時，通常出現效果不佳的情況，下面小編就帶你了解一些的PCR實驗的優化方法：

一、基本參數的優化

1.1 MgCl2的濃度　在PCR反應中，MgCl2的濃度對影響酶的活性是至關重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應慎重

一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應，應選擇2－5 mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RT－PCR而言，則應選擇的濃度為4－8 mM。

1.2 模板的濃度：如果研究者是進行實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進行實驗。

一般而言，使Cp位于15－30個循環比較合適，若大于30則應使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經驗上是SYBR Green I探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。

二、使用SYBR Green I測定DNA時的條件優化

2.1 MgCl2的濃度：大多數引物－模板對其的要求是2－4 mM。

2.2 模板的濃度：初次實驗要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。基因組DNA在50 ng-5 pg之間選擇，質粒DNA在106拷貝數左右選擇。

2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達到好的效果，反會使反應的敏感度降低，所以，研究者若要進行實時定量PCR研究，最好選用純化的模板。

2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素，其濃度太低，會致使反應不完，若引物太多，則發生錯配以及產生非特異的產物的可能性會大大增加。對于大多數PCR反應，0.5 uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.3－1.0 uM之間進行選擇，直至達到滿意的結果。

2.6 退火溫度：實驗設置的退火溫度應比計算得出的Tm值小5 ℃，然后在1－2 ℃內進行選擇。一般地，退火溫度要根據經驗來確定，這個經驗值往往會同計算得到的Tm值有較大的差距。

三、用SYBR Green I進行一步法RT－PCR的條件優化

3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8 mM之間選擇。

3.2 模板的濃度：RT－PCR實驗既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應在1 pg-1 ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進行測定。

3.3 對照設置：每一引物都應設有陰性對照，陽性對照和污染對照。

四、雜交探針測定DNA

4.1 MgCl2的濃度：在2－4 mM的基礎上加0.5－1.0 mM，但是不要超過2.0 mM。

4.2 雜交探針的濃度：初次實驗每個探針用0.2 uM，如果信號強度達不到要求，可以增加至0.4 uM。

4.3 對照設置：每一引物都要設陰性對照，每一探針都要設陰性對照。每次實驗都要設陽性對照。

4.4 其它的條件同SYBR Green I。

五、用雜交探針實時定量RT－PCR

5.1 MgCl2的濃度：在4－8 mM之間進行選擇。

5.2 雜交探針的濃度：初實驗用0.2 uM，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4 uM。

5.3 模板濃度設置：優化的擴增須進行一系列知釋度的實驗，在條件有困難的條件下，至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1 pg-1 ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小（小于10 ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。

5.4 對照設置：每個引物都要設無模板對照，陽性對照以及污染對照。

六、關于雜交探針的評價

在使用雜交探針進行實驗時，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應過程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因為探針可與引物的3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應的原料，致反應的效率下降。

探針其本身能同目的基因相結合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發延伸反應，為了防止發生這種現象，通常是將其3’末端全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不全或是沒有磷酸化，就會產生目的基因的副產品，從而干擾實驗結果。鑒于以上這兩點，所以應對探針精心設計，并將其末端全磷酸化。